Durante lo studio delle proteine e lo sviluppo di nuovi biofarmaci la struttura terziaria e quaternaria giocano un ruolo centrale nella definizione dell'attività della biomolecola. A causa della natura complessa dei biofarmaci, rispetto ai farmaci di stampo chimico, le tecniche biofisiche diventano strumenti importanti e fondamentali per la caratterizzazione delle strutture molecolari superiori (HOS – High Order Structure) per definire la stabilità, la conformazione, il folding, la struttura e l'attività funzionale.

Questa complessità può essere caratterizzata mediante diversi metodi biofisci tra cui:

• Spettrometria di massa (MS)
• Dicroismo Circolare (CD)
• Spettroscopia Infrarosso (FT-IR)
• Spettroscopia Raman
• Cristallografia raggi-X
• Risonanza Magnetica Nucleare (NMR)
• Dicroismo Circolare near-UV
• GPC/SEC
• Field Flow Fractionation
• Fluorescenza
• Light scattering statico e dinamico (SLS e DLS)
• Microcalorimetria a scansione differenziale (DSC)
• Ultracentrifugazione analitica (AUC)

Grazie a tecnologie complementari ed ortogonali, le informazioni sulla struttura complessa delle proteine sono efficacemente utilizzate per prendere decisioni su quale molecola far avanzare nel processo di ricerca e sviluppo, come ottimizzare la formulazione, per il controllo qualità in tutte le fasi di produzione e per studi di biocomparibilità.

Industrie e ricercatori accademici del settore biofarmaceutico, così come le agenzie governative, sono sempre più consapevoli del ruolo fondamentale che HOS gioca nella stabilità e nella funzione biologica dei prodotti farmaceutici. A sottolineare questa importanza è l'inclusione della caratterizzazione biofisica dell'HOS nella sottomissione dei prodotti agli enti di regolamentazione.

Negli ultimi anni, l'approccio del Quality by Design (QbD) è stato suggerito dalla FDA degli Stati Uniti e dalla International Conference on Harmonization (ICH). L'approccio QbD è definito come "un approccio sistematico per lo sviluppo che inizia con gli obiettivi prefissati e irrobustisce la comprensione del prodotto e del processo basandosi su solidi dati scientifici e la gestione del rischio".
I vantaggi dell'approccio QbD sono svariati e includono:

• Migliore progettazione del prodotto
• Riduzione dei problemi nella fase manifatturiera
• Comprensione e mitigazione dei rischi
• Riduzione del costo complessivo di fabbricazione
• Rapida approvazione degli enti regolatori
• Miglioramento continuo
• Fornire una migliore comprensione dei processi

L'approccio QbD comporta una comprensione completa del prodotto biofarmaceutico e dei processi nella produzione del farmaco: dalla coltura cellulare fino ai processi di purificazione, filtrazione, formazione e confezionamento. Le proteine, o più in generale le biomolecole, hanno attributi che possono essere suscettibili di modifiche strutturali influenzabili dai processi di produzione elencati. È fondamentale che questi processi siano progettati per controllare gli attributi chiave della proteina, critici per mantenerne la struttura e l'attività funzionali della proteina. Utilizzare metodi per la caratterizzazione HOS in un approccio QbD consiste nel collegare qualsiasi modifica strutturale della proteina ai cambiamenti nella sua funzione biologica.

Lo scopo del QbD è quello di incoraggiare le aziende farmaceutiche ad incrementare la comprensione dei propri prodotti e processi produttivi, garantendo che questi ultimi siano robusti.

Esempio applicativo

Di seguito riportiamo un esempio applicativo a dimostrazione dell'alto contenuto informativo dei risultati DSC e della trasversalità dell'output analitico lungo tutta la filiera R&D e manufacturing:

L'ossidazione delle catene laterali di aminoacidi è una delle principali via di degradazione delle proteine terapeutiche. Come risultato dell'ossidazione si ha una compromissione dell'efficacia e stabilità del prodotto.

Recentemente è stato presentato il webinar "Using DSC to investigate the impact of oxidation on protein structure" che descrive l'uso della microcalorimetria DSC per lo studio dei cambiamenti strutturali connessi all'ossidazione della metionina, dimostrando la sensibilità del DSC nel valutare, in più classi di proteine, la variazione di stabilità conformazionale indotta da questo stress ossidativo.
Per tutte le proteine oggetto di studio, la Tm determinata tramite DSC è risultata decrescere linearmente con l'aumento dei livelli MetOx. In confronto, tecniche spettroscopiche ortogonali di caratterizzazione strutturale (near-UV CD e spettroscopia di fluorescenza) sono risultate molto meno sensibili alle variazioni conformazionali ossidazione-indotte. Questo suggerisce come la microcalorimetria DSC sia un metodo di caratterizzazione strutturale più appropriato per monitorare l'ossidazione delle proteine rispetto ad altri metodi spettroscopici.

L'anticorpo monoclonale IgG2 ha più domini strutturali. Sulla sua catena pesante sono presenti diverse metionine, potenziali bersagli per l'ossidazione e la formazione di metionina solfossido. M253 (sulla CH2 nella regione Fc) è il residuo di metionina più sensibili all'ossidazione.
La sensibilità della tecnica DSC ha permesso di rilevare questa specifica ossidazione da cambiamenti nella Tm. Lo studio ha dimostrato che questi cambiamenti hanno effettivamente preceduto una perdita di affinità relativa, dimostrando che la DSC è un indicatore importante della diminuzione del legame anticorpo-antigene.

Questi risultati suggeriscono che la Tm misurata dalla microcalorimetria DSC può essere uno strumento utile e predittivo per chiarire l'impatto di eventuali modifiche di produzione e di processo sulla struttura delle proteine e relativi cambiamenti conformazionali a potenziale impatto funzionale. Questo può avere un forte impatto positivo sulla qualità del processo biofarmaceutico.